抗真菌藥物篩選和活性評價指導(dǎo)手冊

本書內(nèi)容主要基于作者團隊建立的多種用于抗真菌藥物篩選和活性評價的醫(yī)學(xué)真菌生物實驗標準操作方法，旨在為真菌藥物研發(fā)提供參考依據(jù)。主要內(nèi)容分為四篇：第1篇，體外抗真菌活性篩選常用方法；第2篇，抗真菌作用機制研究常用方法；第3篇，真菌感染動物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評價；第4篇，常用的真菌分子生物學(xué)實驗及應(yīng)用舉例。
本書可為真菌相關(guān)研究的科研工作者提供標準和參考。

劉娜，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系副教授、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為抗真菌藥物研究，主要聚焦于抗真菌新靶點、新機制和新分子骨架發(fā)現(xiàn)。作為項目負責(zé)人主持國家自然科學(xué)基金面上項目（2項）、青年基金、軍隊生物安全研究專項等6項研究課題；作為項目骨干參與國家杰出青年科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃、上海市教委科技創(chuàng)新重大項目、上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人等項目。發(fā)表SCI論文27篇，獲授權(quán)發(fā)明專利17項，參編中英文專著6部。作為主要完成人獲得上海市科技進步二等獎，入選海軍軍醫(yī)大學(xué)遠航人才計劃和A級優(yōu)秀教員，擔(dān)任《中南藥學(xué)》雜志編委。

真菌感染是臨床上一類常見病、多發(fā)病，分為深部真菌感染和淺部真菌感染。近年來，隨著免疫受損人群的增加，深部真菌感染的發(fā)病率和致死率大幅上升。據(jù)統(tǒng)計，每年約有數(shù)十億人會受到真菌感染，其中數(shù)百萬人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染臨床治療的抗真菌藥物數(shù)量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐藥性嚴重等問題，現(xiàn)有的抗真菌藥物遠遠不能滿足臨床的需要。因此，開發(fā)新型的抗真菌藥物十分必要。國內(nèi)抗真菌藥物研發(fā)水平相對薄弱，抗真菌活性化合物發(fā)現(xiàn)和生物活性評價相對脫節(jié)，致使一些具有較好抗真菌活性的分子沒有得以深入的研究和評價。海軍軍醫(yī)大學(xué)盛春泉、劉娜團隊多年來致力于抗真菌藥物研究工作，建立了多種用于抗真菌藥物篩選和活性評價的醫(yī)學(xué)真菌生物實驗標準操作方法，其中包括體外抗真菌活性測試方法、系統(tǒng)性真菌感染動物模型的構(gòu)建、體內(nèi)抗真菌活性評價方法，以及與真菌相關(guān)的細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)實驗方法，并以此為基礎(chǔ)開展了大量的抗真菌新藥發(fā)現(xiàn)和作用機制研究，以及抗真菌新靶點發(fā)現(xiàn)和驗證工作。本書是這些方法的歸納總結(jié)，對從事真菌藥物研發(fā)有重要的參考價值。

真菌感染是臨床上一類常見病、多發(fā)病，分為深部真菌感染和淺部真菌感染。近年來，隨著免疫受損人群的增加，深部真菌感染的發(fā)病率和致死率大幅上升。據(jù)統(tǒng)計，每年有數(shù)十億人會受到真菌感染，其中數(shù)百萬人所受感染是危及生命的。目前用于深部真菌感染臨床治療的抗真菌藥物數(shù)量十分有限，且普遍存在毒副作用大、耐藥性嚴重等問題，現(xiàn)有的抗真菌藥物遠遠不能滿足臨床的需要。因此，開發(fā)新型的抗真菌藥物十分必要。
藥物研發(fā)的基本流程：首先，針對疾病或靶標建立生物活性評價方法；其次，篩選或者設(shè)計先導(dǎo)化合物；進而，對先導(dǎo)化合物進行結(jié)構(gòu)優(yōu)化的同時進行逐級評價，通常先體外評價生物活性和選擇性，再通過動物模型測試體內(nèi)生物活性。目前，國內(nèi)抗真菌藥物研發(fā)水平相對薄弱，抗真菌活性化合物發(fā)現(xiàn)和生物活性評價相對脫節(jié)，致使一些具有較好抗真菌活性的分子沒有得以深入的研究和評價，而如何提高國內(nèi)抗真菌藥物研究的整體水平是業(yè)內(nèi)同行共同關(guān)注的問題。
作者研究團隊多年來致力于抗真菌藥物研究工作，在參考大量文獻的基礎(chǔ)上，結(jié)合實際經(jīng)驗，建立了多種用于抗真菌藥物篩選和活性評價的醫(yī)學(xué)真菌生物實驗標準操作方法，其中包括體外抗真菌活性測試方法、系統(tǒng)性真菌感染動物模型的構(gòu)建、體內(nèi)抗真菌活性評價方法，以及與真菌相關(guān)的細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)實驗方法，并以此為基礎(chǔ)開展了大量的抗真菌新藥發(fā)現(xiàn)和作用機制研究，以及抗真菌新靶點發(fā)現(xiàn)和驗證工作。本書將上述真菌生物實驗方法進行梳理、總結(jié)，形成了四部分內(nèi)容：第1篇，體外抗真菌活性篩選常用方法；第2篇，抗真菌作用機制研究常用方法；第3篇，真菌感染動物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評價；第4篇，常用的真菌分子生物學(xué)實驗及應(yīng)用舉例。此外，附錄中羅列了常見病原真菌活化、凍存方法以及常用培養(yǎng)基的配制方案，旨在為同行提供參考的依據(jù)，助力抗真菌藥物的研究。
本書的編寫是在多位老師和研究生的共同努力下完成的，書中的實驗方法在國家自然科學(xué)基金重點項目（No. 82330109）、國家杰出青年科學(xué)基金（No. 81725020）、國家自然科學(xué)基金面上項目（No. 82373734，No. 81973175）等多項基金的資助下建立，本書的編寫也得到多位同行的支持和幫助，在此一并表示感謝。
因?qū)W識和能力有限，書中難免存在不足之處，敬請讀者批評指正。

編者
2024年6月

第1篇 體外抗真菌活性篩選常用方法  001
1 體外抗真菌活性測試  002
2 體外協(xié)同抗真菌活性測試  006
3 馬拉色菌的體外抗真菌活性測試  010

第2篇 抗真菌作用機制研究常用方法  013
4 真菌與腫瘤細胞互作實驗  014
5 平皿/紙片擴散實驗  017
6 時間-生長曲線測試  020
7 時間-殺菌曲線測試  023
8 生物被膜形成抑制實驗  026
9 成熟生物被膜清除實驗  029
10 菌絲生長抑制實驗  033
11 尿素酶生成抑制實驗  036
12 黑素抑制實驗  039
13 莢膜生長抑制實驗  042
14 莢膜多糖含量測定實驗  045
15 真菌細胞表面疏水性測試  048
16 透射電子顯微鏡實驗  051
17 真菌細胞共定位成像  054
18 真菌活細胞激光共聚焦實時成像  057
19 甾醇含量測定實驗  060
20 細胞周期實驗  063
21 細胞凋亡實驗  066

第3篇 真菌感染動物模型建立及體內(nèi)抗真菌活性評價  069
22 小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染模型  070
23 小鼠隱球菌性腦膜炎模型  073
24 小鼠皮膚感染模型  077
25 小鼠陰道炎感染模型  080
26 大蠟螟幼蟲模型  084
27 線蟲實驗  087
28 血腦屏障透過實驗  090

第4篇 常用的真菌分子生物學(xué)實驗及應(yīng)用舉例  093
29 基因敲除技術(shù)  094
30 實時RT-PCR 實驗  100
31 Western blot 實驗  103
32 Hsp90 抑酶活性測試  106
33 HDAC 抑酶活性測試  110
34 組蛋白去甲基化酶抑酶活性測試  113

附錄  121
附錄1 常見病原真菌及其活化、凍存方法  122
附錄2 常用培養(yǎng)基及緩沖溶液的配制方法  127
附錄3 實驗相關(guān)儀器  131
附錄4 縮略語表  132

參考文獻  134